Імуноферментний аналіз (ІФА) є одним із найбільш широко використовуваних та важливих методів лабораторної діагностики у сучасній медицині. Цей високочутливий та специфічний метод дозволяє визначати наявність та концентрацію різних речовин у біологічних рідинах, що має велике значення для діагностики захворювань, моніторингу ефективності лікування та проведення наукових досліджень.
Важливість імуноферментних аналізаторів у сучасній лабораторній практиці важко переоцінити. Ці прилади забезпечують високу продуктивність, точність і відтворюваність результатів, що важливо для прийняття правильних клінічних рішень. Однак, незважаючи на високу автоматизацію та технологічність сучасних аналізаторів, проведення ІФА залишається складним багатоетапним процесом, на кожному етапі якого можуть виникнути помилки, здатні суттєво вплинути на кінцевий результат дослідження.
Точність досліджень, що проводяться на імуноферментних аналізаторах, є наріжним каменем лабораторної діагностики. Від неї залежить як правильність постановки діагнозу, а й вибір тактики лікування, а деяких випадках - життя пацієнта. Помилки результатів ІФА можуть призвести до неправильної інтерпретації клінічної картини, призначення неадекватного лікування або, навпаки, відсутності необхідного втручання.
У зв'язку з цим розуміння потенційних джерел помилок на всіх етапах проведення імуноферментного аналізу та знання методів їх запобігання є критично важливим для кожного фахівця лабораторної діагностики. У цій статті ми докладно розглянемо основні види помилок, що виникають під час проведення ІФА, та обговоримо заходи, спрямовані на забезпечення якості лабораторних досліджень.
Помилки, що виникають на преаналітичному етапі під час проведення імуноферментного аналізу
Преаналітичний етап є одним із найбільш критичних у процесі лабораторного дослідження. Помилки, допущені цьому етапі, можуть суттєво вплинути на достовірність результатів ІФА. Розглянемо основні чинники, які необхідно враховувати мінімізації помилок на преаналітичному етапі.
Біологічні фактори, пов'язані з особистістю пацієнта
При інтерпретації результатів ІФА дуже важливо враховувати індивідуальні особливості пацієнта, які можуть впливати на рівні визначених аналітів.
Стать пацієнта
Існують значні відмінності у рівнях багатьох клініко-хімічних та гематологічних показників між чоловіками та жінками. Особливо це стосується гормональних досліджень. Наприклад, рівні прогестерону, тестостерону та деяких транспортних білків можуть суттєво відрізнятися залежно від статі. Важливо, що референтні інтервали, що наводяться в методичних посібниках, часто є орієнтовними і можуть не підходити для всіх лабораторій. Тому кожна лабораторія має встановлювати власні референтні інтервали з урахуванням статевих відмінностей.
Вік пацієнта
Концентрація багатьох аналітів значно змінюється протягом життя. Наприклад, рівні гемоглобіну або білірубіну істотно різняться у новонароджених, дітей, дорослих та людей похилого віку. При інтерпретації результатів ІФА необхідно враховувати вікові норми кожного конкретного показника.
Біологічні ритми
Добові та сезонні ритми можуть значно впливати на концентрації аналізованих речовин. Особливо це стосується гормональних досліджень. Наприклад, рівень кортизолу схильний до значних коливань протягом доби, досягаючи піку в ранкові години і знижуючись до вечора. Тому для отримання достовірних результатів важливо дотримуватись рекомендованого часу забору крові (зазвичай між 9 і 11 годиною ранку для кортизолу).
Вагітність та менструальний цикл
Ці фізіологічні процеси викликають значні зміни у рівнях гормонів та інших біохімічних показників. При інтерпретації результатів ІФА у жінок репродуктивного віку необхідно враховувати фазу менструального циклу, а у вагітних – термін гестації.
Фізичні та стресові навантаження
Навіть такі, начебто, незначні чинники, як становище тіла пацієнта під час взяття крові, можуть проводити концентрацію деяких аналітів. Наприклад, рівень альдостерону може суттєво змінюватися залежно від того, чи перебуває пацієнт у вертикальному чи горизонтальному положенні. Стресові ситуації, у тому числі сама процедура взяття крові, можуть впливати на рівні кортизолу та катехоламінів.
Прийом лікарських препаратів
Багато лікарських засобів можуть значно змінювати результати лабораторних аналізів. Наприклад, допамін знижує рівень тиреотропного гормону (ТТГ), а деякі психотропні препарати можуть впливати на рівень пролактину. При призначенні ІФА важливо зібрати повний анамнез пацієнта, включаючи інформацію про ліки, що приймаються.
Дієта та споживання рідини
Харчові навички пацієнта можуть впливати на результати деяких аналізів. Наприклад, вживання кофеїну може змінювати активність плазматичного реніну та концентрацію катехоламінів, а голодування впливає на рівень кортизолу. Тому перед деякими видами аналізів пацієнтам рекомендується дотримуватись певної дієти або голодувати протягом певного часу.
Чинники, пов'язані з умовами відбору проб
Місце відбору зразка
Залежно від мети дослідження та обумовленого аналіту, зразки крові можуть братися з вени, артерії чи капілярів. Важливо пам'ятати, що рівні деяких речовин капілярної і венозної крові можуть значно відрізнятися. Наприклад, концентрація глюкози в капілярній крові зазвичай вища, ніж у венозній.
Об'єм крові, що відбирається
Недостатня кількість крові може призвести до того, що об'єму сироватки або плазми не вистачить для всіх необхідних аналізів. Це може вимагати повторного взяття крові, що не тільки незручно для пацієнта, але може призвести до спотворення результатів через стресу.
Періодичність взяття проб
У динамічних дослідженнях дуже важливо враховувати біологічне напівжиття аналітів та фармакокінетичні властивості ліків. Наприклад, для оцінки рівня простат-специфічного антигену (ПСА) після операції на передміхуровій залозі зразки крові слід брати не раніше ніж через 10-14 днів після втручання.
Використання антикоагулянтів
Для деяких видів аналізів потрібне обов'язкове додавання антикоагулянтів для запобігання руйнуванню нестабільних сполук. Наприклад, для визначення реніну або катехоламінів необхідно використовувати спеціальні пробірки з антикоагулянтами.
Температурні умови
Температура при взятті та обробці зразків дуже важлива для збереження нестабільних з'єднань. Наприклад, проби крові на визначення деяких гормонів повинні відразу поміщатися в лід для запобігання їх руйнуванню.
Ідентифікація проб
Маркування проб
Правильне та чітке маркування проб є критично важливим аспектом преаналітичного етапу. Помилки в ідентифікації зразків можуть призвести до катастрофічних наслідків, коли результати аналізу одного пацієнта приписуються іншому. Кожна пробірка має бути однозначно ідентифікована із зазначенням прізвища пацієнта, номера історії хвороби чи унікального ідентифікаційного номера, дати та часу забору зразка.
Транспортування проб у лабораторію
Умови транспортування: Пробірки із зразками повинні бути герметично закриті та поміщені у спеціальні контейнери для запобігання їх пошкодженню під час транспортування. Важливо дотримуватись температурного режиму при транспортуванні, особливо якщо йдеться про термолабільні аналіти. Деякі види проб потребують транспортування в охолодженому чи замороженому стані.
Первинна обробка проб
Проби цільної крові повинні бути доставлені в лабораторію якнайшвидше, бажано не пізніше 45 хвилин після взяття. Обробка проб (центрифугування, відділення сироватки або плазми) повинна бути завершена протягом години після забору крові. Це особливо важливо для запобігання руйнуванню нестабільних аналітів та мінімізації впливу клітинного метаболізму на склад плазми.
Якщо аналіз не проводиться відразу після обробки проб, зразки сироватки або плазми повинні бути заморожені при -20°C або нижче. Недотримання цих умов може призвести до деградації деяких аналітів та серйозно спотворити результати дослідження. Важливо також враховувати, що деякі аналіти нестабільні навіть при заморожуванні та потребують особливих умов зберігання.
Таким чином, преаналітичний етап є важливим для забезпечення достовірності результатів імуноферментного аналізу. Суворе дотримання всіх вимог на цьому етапі дозволяє мінімізувати помилки та забезпечити високу якість лабораторних досліджень.
Помилки, що виникають на аналітичному етапі проведення імуноферментного аналізу (ІФА)
Аналітичний етап є ключовим у процесі ІФА. На цьому етапі відбувається безпосереднє виконання аналізу і будь-які помилки можуть призвести до отримання недостовірних результатів. Розглянемо основні джерела помилок на аналітичному етапі та способи їх запобігання.
Погана організація роботи у лабораторії
Захаращеність лабораторії та нестача місця для аналізу можуть призвести до випадкових помилок, таких як протока реагентів або неправильне їх внесення в лунки планшета. Важливо, щоб робочий простір був організований таким чином, щоб зменшити ризик таких помилок. Всі необхідні реагенти та обладнання мають бути легко доступними, а робоча поверхня повинна бути чистою та вільною від зайвих предметів.
Температура в лабораторії повинна бути підтримана в межах +18-25°C. Відхилення від цього діапазону можуть призвести до зміни оптичної щільності розчинів у лунках, погіршення чутливості методу та звуження діапазону визначених концентрацій. Особливу увагу слід приділити розташуванню нагрівальних приладів – вони повинні знаходитись на достатній відстані від планшетів, щоб уникнути нерівномірного прогрівання лунок.
Робота з імуноферментними наборами часто пов'язана з використанням потенційно небезпечних хімічних реагентів, таких як кислоти та консерванти. Відсутність адекватної вентиляції може створювати не тільки небезпеку для здоров'я персоналу, але й впливати на якість виконання аналізу. Тому важливо, щоб приміщення лабораторії було обладнане ефективною витяжною вентиляцією.
Помилки, пов'язані з лабораторним обладнанням
Точність дозування розчинів є критично важливим фактором ІФА. Навіть невеликі відхилення в обсягах реагентів, що вносяться, можуть призвести до значних похибок у результатах. Тому дозатори необхідно регулярно перевіряти на точність, не рідше одного разу на місяць, а краще щотижня. Крім того, персонал повинен бути навчений правильної техніки роботи з дозаторами.
Якщо пристрій, що промиває, для планшетів працює неправильно (наприклад, засмічення каналів), це може призвести до неповного видалення реагентів і спотворення результатів. Важливо щодня перевіряти роботу пристрою та промивати його дистильованою водою після використання.
Недостатнє прогрівання спектрофотометра перед використанням може призвести до похибок у вимірюваннях. Для коректної роботи приладу важливо дотримуватися рекомендацій щодо його експлуатації та регулярно проводити калібрування.
Температура у термостаті має бути стабільною, а її контроль необхідно здійснювати за допомогою додаткового термометра. Підсихання лунок під час інкубації можна запобігти використанню вологої камери або спеціального паперу для заклеювання планшетів.
Неправильна частота струшування шейкера може вплинути на результати аналізу. Занадто інтенсивне струшування може призвести до десорбції реагентів, а недостатнє до зниження оптичної щільності.
Помилки під час підготовки зразків до аналізу
Розморожування проб
Зразки, що надходять у замороженому вигляді, необхідно розморожувати при кімнатній температурі і ретельно перемішувати, щоб уникнути концентрації градієнта сироваткових компонентів.
Центрифугування
Зразки зі згустками фібрину або опадами повинні бути центрифуговані для отримання гомогенного супернатанту. Проби з ознаками мікробіологічного проросту не можна використовувати.
Розведення зразків
Розведення проб повинно проводитись з використанням одноразових наконечників для кожної проби, щоб уникнути контамінації. Важливо ретельно перемішувати розведені проби перед аналізом.
Помилки під час підготовки компонентів набору до роботи
Якість дистильованої води
Вода з домішками, такими як хлор може знижувати сигнал і збільшувати варіабельність результатів. Вода має бути свіжою та зберігатися в належних умовах.
Розчинення ліофілізованих препаратів
Необхідно ретельно розчиняти ліофілізовані компоненти, щоб уникнути втрат та забезпечити точність концентрацій.
Температура реагентів
Усі компоненти набору мають бути доведені до кімнатної температури перед початком аналізу. Внесення холодних реагентів може призвести до недостовірних результатів, особливо за методиками з короткою інкубацією.
Порушення правил зберігання та використання підготовлених компонентів набору:
- Калібрувальні проби та контрольна сироватка. Тривале зберігання розкритих флаконів на робочому столі може призвести до викривлення результатів через випаровування або адсорбцію вологи.
- Розчин субстрату тетраметилбензидину (ТМБ). Цей реагент повинен зберігатись у темному місці при температурі +2-8°C. Мимовільне фарбування розчину через контамінацію робить його непридатним для аналізу.
Стабільність розкритого набору. Дробове використання набору може призвести до псування реагентів та спотворення результатів. Рекомендується мінімізувати кількість циклів повторних визначень із використанням розкритих наборів.
Помилки під час проведення аналізу
Випадкові помилки при внесенні компонентів включають використання неправильних реагентів, порушення їх послідовності внесення, дозування неправильних обсягів і т.п. Ці помилки вимагають візуального контролю та досвідченого персоналу.
Проведення аналізу в моноплікатах – аналіз в одному примірнику збільшує ризик отримання невірних результатів. У такому разі неможливо оцінити варіабельність даних.
Важливо мінімізувати час між внесенням різних реагентів, щоб уникнути зміни параметрів зв'язування та спотворення результатів.
Неправильне відмивання лунок планшета може призвести до варіабельності результатів. Дуже сильний вакуум або дуже слабка аспірація можуть пошкодити білкове покриття або залишити краплі рідини в лунках.
Вимір оптичної щільності повинен проводитися не пізніше 15 хвилин після внесення стоп-реагенту, щоб запобігти подальшій зміні оптичної щільності розчинів.
Заходи, спрямовані на забезпечення якості лабораторних досліджень
Одним із фундаментальних аспектів забезпечення якості є ретельний вибір постачальників реагентів та діагностичних наборів. Пріоритет слід віддавати продукції, що відповідає міжнародним стандартам і містить атестовані калібрувальні та контрольні матеріали. Це сприяє сумісності результатів між різними лабораторіями та підвищує достовірність аналізів.
Не менш важливим фактором є правильна організація лабораторного простору та оснащення сучасним обладнанням. Використання застарілих приладів може суттєво знизити точність результатів та збільшити ризик помилок. Крім того, акредитація лабораторій відповідно до національних та міжнародних стандартів необхідна для підтримки високого рівня якості досліджень.
Впровадження систем внутрішньо- та міжлабораторного контролю якості є невід'ємною частиною забезпечення надійності результатів. Внутрішньолабораторний контроль спрямовано стандартизацію всіх етапів аналізу, від підготовки реагентів до реєстрації результатів. Міжлабораторний контроль дозволяє оцінити сумісність результатів, отриманих у різних установах, та їх відповідність міжнародним стандартам.
Особливу увагу слід приділяти основним критеріям якості вимірювань, таким як точність, правильність, збіжність та відтворюваність. Використання атестованих та неатестованих контрольних матеріалів дозволяє ефективно оцінювати ці параметри та своєчасно виявляти відхилення.
Забезпечення якості лабораторних досліджень – це безперервний процес, що потребує постійного вдосконалення методик, навчання персоналу та впровадження нових технологій. Тільки комплексний підхід, що включає всі перелічені вище заходи, може гарантувати високу точність і достовірність результатів, що в кінцевому підсумку сприяє поліпшенню якості медичної допомоги та здоров'я пацієнтів.
