Загальний аналіз сечі залишається одним із найчастіше призначуваних лабораторних досліджень і водночас одним із найбільш чутливих до порушень преаналітичного етапу. Метод «сухої хімії» на багатопараметричних тест-системи дозволив за лічені хвилини отримувати попередню оцінку фізико-хімічних властивостей сечі та орієнтуватися, яким зразкам потрібне подальше мікроскопічне дослідження осаду. У цій статті розглянемо, як влаштовані тест-смужки для аналізу сечі, за якими правилами готувати та досліджувати зразки, який хімічний механізм лежить в основі визначення кожного аналіту, а також які фактори можуть спотворювати результат.
Перші тест-смужки із нанесеними сухими реагентами для визначення глюкози в сечі з'явилися на ринку ще у 1956 році (компанія Bayer). Відтоді технологія сухої хімії постійно вдосконалювалася: до однокомпонентного тесту на глюкозу поступово додавалися нові реагентні зони, і сучасна поліфункціональна тест-смужка дозволяє за одне занурення отримати якісну або напівкількісну оцінку одразу 8–10 параметрів - білка, глюкози, кетонів, білірубіну, уробіліногену, крові, лейкоцитів, нітритів, відносної густини та pH.
Що таке метод сухої хімії та навіщо він потрібен
Багатофункціональні (поліфункціональні) тест-смужки - це вузькі пластикові носії, на які нанесено кілька окремих реагентних зон. Кожна зона просочена реактивами, чутливими до конкретного аналіта чи фізичного параметра сечі. При контакті з рідиною відбувається хімічна реакція, яка супроводжується зміною забарвлення індикаторної зони. Інтенсивність кольору корелює з концентрацією досліджуваної речовини.
Важливо розуміти принципову особливість цього методу: тест-смужка не «бачить» самі клітини, вона реєструє біохімічні маркери, які з високою ймовірністю корелюють із наявністю формених елементів у сечі. Наприклад:
●позитивний тест на гемоглобін опосередковано свідчить про наявність еритроцитів (у тому числі лізованих, які вже неможливо виявити мікроскопічно);
●позитивний естеразний тест вказує на присутність лейкоцитів, оскільки лейкоцитарна естераза — фермент, що міститься у гранулоцитах.
Саме тому скринінг тест-смужками не замінює мікроскопію осаду повністю, а слугує інструментом сортування зразків.
Отриманий результат обліковують одним із двох способів:візуально, порівнюючи забарвлення реагентної зони з еталонною кольоровою шкалою на упаковці, або автоматично, за допомогою відбивного (рефлектометричного) фотометра — аналізатора, який об'єктивізує оцінку кольору та мінімізує суб'єктивну похибку оператора. Водночас, незалежно від способу обліку, тест-смужки мають технологічно зумовлені обмеження чутливості та специфічності, тому хибнопозитивні й хибнонегативні результати трапляються нерідко. Таким чином кожен лаборант повинен знати не лише порядок дій, а й хімічну природу реакцій та типові джерела похибок.
Клінічні переваги методу
●Скорочення навантаження на мікроскопію. Зразки з негативним результатом за всіма патологічними параметрами («здорові» проби) можуть не направлятися на мікроскопічне дослідження, що економить час лаборанта.
●Виявлення лізованих клітин. Еритроцити та лейкоцити, що зруйнувалися ще до мікроскопії (через низьку відносну густину сечі, тривале зберігання тощо), при мікроскопії вже не візуалізуються, тоді як хімічна реакція на гемоглобін чи естеразу все ще залишається позитивною.
●Швидкість і стандартизація.Результат оцінюється протягом 1–2 хвилин, що дозволяє включати аналіз сечі у потік рутинних досліджень без значних часових витрат.
●Об'єктивізація попереднього скринінгу. Наявність референтної кольорової шкали на упаковці мінімізує суб'єктивність трактування — за умови дотримання методики.
Як правильно підготувати зразок
Результат дослідження сухою хімією значною мірою залежить від того, наскільки коректно зразок був зібраний, збережений і доставлений до лабораторії. Порушення на цьому етапі - одна з найчастіших причин хибних результатів, і саме на нього лаборант має найбільший вплив.
Основні вимоги до зразка
- Сеча повинна мати кімнатну температуру на момент тестування. Якщо контейнер зберігався в холодильнику, його обов'язково витримують до зрівняння з кімнатною температурою — холодна рідина уповільнює хімічні реакції на реагентних зонах і спотворює результат.
- Контейнер не повинен піддаватися впливу температур вище +30 °C та прямого сонячного проміння — це прискорює деградацію лабільних сполук, зокрема білірубіну.
- Зразки, що містять харчові або лікарські барвники (наприклад, після вживання буряка, вітамінних комплексів, деяких антибіотиків), виключаються з дослідження, оскільки забарвлення рідини заважає коректно оцінити колір індикаторних зон.
- Для тестування використовують виключно свіжу нецентрифуговану сечу — центрифугування видаляє клітинний осад і не впливає на результат хімічного скринінгу, тому в цьому немає сенсу, а сама процедура лише подовжує час до аналізу.
Чому важливий час від збору до дослідження
Сеча — нестабільне біологічне середовище, і зміни в ній починаються вже за кілька десятків хвилин після сечовипускання. Що довше зразок очікує дослідження, то менш достовірним стає результат. Основні зміни, які відбуваються з часом:
●зниження прозорості внаслідок кристалізації розчинених солей;
●підвищення pH через розщеплення сечовини бактеріальною уреазою з утворенням аміаку;
●зниження концентрації кетонових тіл і глюкози; кетони летючі й випаровуються, глюкоза частково утилізується мікрофлорою та лейкоцитами;
●руйнування білірубіну під впливом світла та кисню;
●лізис еритроцитів та інших клітинних елементів, особливо швидко в гіпотонічній чи лужній сечі;
●розмноження сторонньої бактеріальної флори, що спотворює як хімічні, так і мікроскопічні показники.
Оптимально досліджувати сечу протягом 1–2 годин після збору. Якщо це неможливо, зразок повинен зберігатися в холодильнику при +2…+8 °C не довше кількох годин, з обов'язковим подальшим зігріванням до кімнатної температури перед тестуванням.
Які параметри визначає тест-смужка
Чутливість, кількість реагентних зон та колірна гама індикаторів відрізняються залежно від виробника тест-систем, проте принципово параметри поділяють на три групи.
Хімізм реакцій: як саме «працює» кожна тестова зона
Розуміння механізму реакції — не теоретична розкіш, а практичний інструмент: саме природа хімічної реакції пояснює, чому певні речовини чи стани організму спричиняють хибний результат.
Білок
Реагентна зона працює за принципом«білкової помилки індикатора». Вона містить кислий буфер та індикатор тетрабромфеноловий синій. У кислому середовищі індикатор віддає протони; за наявності білка амінoгрупи білкових молекул захоплюють ці протони, і колір індикатора змінюється з жовтого через зелений до синього. Тест найбільш чутливий доальбуміну(від 0,1 г/л) татрансферину(від 0,2 г/л) — саме в них найбільше аміногруп; інші білки (глобуліни, мукопротеїни, білок Бенс-Джонса) визначаються значно гірше, що є причиною хибнонегативних результатів. Підтверджувальний тест — реакція ізсульфосаліциловою кислотою, яку обов'язково виконують при pH сечі понад 8–9 або при клінічній підозрі на протеїнурію неальбумінової природи.
Глюкоза
Використовується двоетапна ферментативна реакція за участю глюкозооксидази та пероксидази; проміжний продукт — перекис водню. Тест високоспецифічний саме до D-глюкози й не реагує з іншими цукрами (галактозою, лактозою, мальтозою, фруктозою), тому вінне придатний для скринінгу галактоземії у дітей, а традиційна назва «аналіз на цукор» стосовно сухої хімії некоректна.
Кетонові тіла
В основі — реакція з нітропрусидом натрію в лужному середовищі з утворенням рожево-фіолетового комплексу. Реакція найбільш чутлива до ацетооцтової кислоти, слабко реагує з ацетоном ізовсім не виявляє β-гідроксимасляну кислоту— а саме вона переважає при діабетичному кетоацидозі, що є важливим клінічним обмеженням методу.
Кров (гемоглобін/еритроцити)
Тест базується на псевдопероксидазній активності гемоглобіну та міоглобіну, які каталізують окиснення індикатора перекисом водню із появою зеленого забарвлення. Типова аналітична чутливість більшості смужок — гемоглобін із приблизно 10 лізованих еритроцитів або 5 незмінених клітин в 1 мкл нецентрифугованої сечі. Методне розрізняє гематурію, гемоглобінурію та міоглобінурію— для диференціації обов'язкова мікроскопія осаду, а за клінічної підозри на рабдоміоліз — визначення сироваткових ЛДГ, КФК, міоглобіну та гаптоглобіну крові.
Білірубін
Реакція азосполучення: білірубін зв'язується із солями діазонію в сильнокислому середовищі, утворюючи продукт рожево-коричневого кольору.
Уробіліноген
Визначається модифікованою реакцією Ерліха з утворенням сполук рожево-червоного кольору. Реакція високоспецифічна саме до уробіліногену й стеркобіліногену тане залежить від pH сечі.
Лейкоцити (лейкоцитарна естераза)
Фермент лейкоцитарна естераза розщеплює ефір індоксилу; вивільнений індоксил реагує із солями діазонію та дає фіолетове забарвлення. Головна перевага перед мікроскопією — здатність виявляти естеразу навіть після повного лізису лейкоцитів(типово для лужної сечі з низькою відносною густиною). Важливе обмеження:тест-смужки не виявляють лімфоцити.
Нітрити
Ґрунтуються на модифікованій реакції Грісса: нітрати сечі перетворюються на нітрити переважно грамнегативними бактеріями (E. coli, Proteus, Klebsiella, Citrobacter) — найчастішими збудниками інфекцій сечовивідних шляхів. Інтенсивність забарвлення не пропорційна титру бактерій, оскільки рівень нітритів залежить від виду мікроорганізму, тривалості перебування сечі в сечовому міхурі (тому найінформативніша перша ранкова порція) та вихідного вмісту нітратів у їжі.
Відносна густина
Визначається методоміонного обмінуміж поліелектролітом тестової зони та іонами сечі. Тест оптимізований для pH 6,0 і не реагує на недисоційовані речовини— глюкозу, сечовину, креатинін, тому не чутливий до змін густини, спричинених, наприклад, глюкозурією. У патологічних зразках для точного визначення рекомендовано осмометрію або рефрактометрію.
Аскорбінова кислота — контрольна зона
Оскільки аскорбінова кислота (вітамін C) здатна впливати на результати одразу кількох параметрів, більшість сучасних тест-смужок мають окрему реагентну зону для її визначення. Ця реакція недостатньо специфічна й виявляє не лише аскорбінову кислоту, а й інші сильні відновники (зокрема гентизинову кислоту — метаболіт аспірину), проте оскільки їхній вплив на результат аналогічний, зона слугує індикатором достовірності визначення глюкози, еритроцитів, нітритів, білірубіну, уробіліногену, гемоглобіну та відносної густини.При позитивній реакції на аскорбінову кислоту дослідження варто повторити не раніше ніж через 10 годин після останнього вживання вітаміну C.
Алгоритм проведення дослідження сухим методом
Дотримання чіткої послідовності дій — обов'язкова умова відтворюваності результату. Типовий алгоритм роботи з тест-смужками виглядає так:
- Перемішати зразок.Біологічну рідину ретельно перемішують, обережно перевертаючи контейнер (без різкого струшування, щоб уникнути піноутворення).
- Дістати смужку.З туби беруть стільки смужок, скільки необхідно для безпосереднього використання, після чого тубу негайно щільно закривають фабричною кришкою з осушувачем — вологість руйнує реагентні зони, що залишилися.
- Занурити у сечу.Смужку занурюють у досліджувану рідину на 1–2 секунди так, щоб намочилися всі тестові зони.
- Видалити надлишок рідини.Ребром смужки проводять по краю посудини, після чого смужку кладуть у горизонтальне положення на фільтрувальний папір — це запобігає змішуванню реагентів сусідніх зон і підтіканню.
- Оцінити результат у визначений час.Колір зон порівнюють з еталонною шкалою на упаковці. Для більшості параметрів оцінку проводять протягом 1–2 хвилин; винятком є зона лейкоцитів, для якої зазвичай передбачений довший інтервал реакції (згідно з інструкцією виробника).
Зміна забарвлення індикатора, що відбулася пізніше рекомендованого часу (як правило, після 2 хвилин),немає діагностичного значення і не повинна враховуватися під час інтерпретації.
Фактори, що впливають на результат
Жоден скринінговий метод не є абсолютно специфічним. Розуміння можливих джерел хибнопозитивних і хибнонегативних результатів дозволяє лаборанту критично оцінювати отримані дані та за потреби рекомендувати повторне дослідження чи додаткові тести.
Ключові практичні висновки з таблиці
●Аскорбінова кислота— один із найбільш «універсальних» інтерферентів: у високих концентраціях вона здатна спотворювати результати одразу кількох параметрів (густина, глюкоза, нітрити, гемоглобін, білірубін, уробіліноген), тому прийом високих доз вітаміну C пацієнтом варто враховувати при трактуванні аналізу — саме для цього на смужці передбачена окрема контрольна зона.
●pH сечі впливає на достовірність визначення відносної густини, білка та лейкоцитів, тому цей показник доцільно оцінювати комплексно з іншими зонами, а не ізольовано.
●Контамінація посудомийними та дезінфікуючими засобами (особливо на основі четвертинних амонієвих сполук і хлоргексидину) — недооцінена, але поширена причина хибних результатів на білок і кров, яка повністю усувається дотриманням правил преаналітики (використання одноразових стерильних контейнерів).
●Негативний нітритний тест не виключає інфекцію сечовивідних шляхів, оскільки частина клінічно значущих збудників не продукує нітратредуктазу — цей параметр завжди слід оцінювати в комплексі з лейкоцитарною естеразою, клінічною картиною та за потреби бактеріологічним посівом.
●Тест на кетони практично не реагує на β-гідроксимасляну кислоту— переважаючий кетон при діабетичному кетоацидозі, тому негативний або слабопозитивний результат сухою хімією не виключає кетоацидоз і за клінічної підозри потребує визначення кетонів іншими методами.
●Тест на лейкоцити не виявляє лімфоцити— це слід враховувати при трактуванні негативного результату в ситуаціях, де клінічно очікується лімфоцитурія.
Підтверджувальні (верифікаційні) дослідження
У разі сумнівного або клінічно значущого результату сухої хімії доцільно застосувати додаткові методи верифікації:
●Реакція з сульфосаліциловою кислотою— підтверджувальний тест на білок; обов'язкова при pH сечі > 8–9 та за підозри на протеїнурію неальбумінової природи (глобуліни, білок Бенс-Джонса).
●Мікроскопія осаду сечі— необхідна для диференціації гематурії, гемоглобінурії та міоглобінурії, а також для виявлення кристалів білірубіну у сумнівних випадках білірубінурії.
●Осадження гемоглобіну сульфатом амонію— можливий скринінговий тест, проте метод не уніфікований і погано піддається стандартизації.
●Якісний тест Уотсона–Шварца— застосовується для диференціації уробіліногену, порфобіліногену та інших речовин, що інтерферують з реакцією Ерліха.
●Лабораторні дослідження крові(активність ЛДГ, КФК, рівень міоглобіну та гаптоглобіну) — при клінічній підозрі на рабдоміоліз для розмежування гемоглобінурії й міоглобінурії.
Висновки для практики лабораторії
Метод сухої хімії сечі — швидкий, стандартизований і економічно ефективний інструмент первинного скринінгу, який суттєво оптимізує роботу клініко-діагностичної лабораторії. Водночас якість результату критично залежить від:
●дотримання правил преаналітичної підготовки зразка (температура, час, захист від світла, чистота контейнера);
●суворого дотримання методики нанесення та часу оцінки реакції;
●розуміння хімічного механізму кожної реакції — саме воно пояснює, чому певні препарати, харчові речовини чи стани організму спотворюють результат;
●знання лаборантом переліку можливих інтерферентних факторів для кожного параметра та наявності відповідного підтверджувального тесту.
Оскільки тест-смужки різних виробників можуть відрізнятися чутливістю, специфічністю та переліком інтерферентних факторів, ретельне вивчення інструкції конкретного виробника — обов'язковий елемент роботи лаборанта. Розуміння викладених вище принципів дозволяє не лише коректно виконувати дослідження, а й критично інтерпретувати отримані дані, своєчасно направляючи сумнівні або позитивні зразки на підтверджувальну мікроскопію осаду сечі та інші лабораторні тести.
